副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

雷清福¹ 谭素媚²   廖建留³  蓝向波⁴

（1、广东省佛山市南海区狮山镇农村综合办公室，佛山528237  2、广东四会黄岗畜牧技术服务部  3、广东广州市兴达动物药业有限公司，广州511475）

 

副猪嗜血杆菌病即猪格拉译氏病（Glasser’s disease）,又称纤维素性浆膜炎和关节炎，其病原为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）,是一种革兰氏阴性短小杆菌。主要以咳嗽、呼吸困难、消瘦、关节肿胀、跛行为为主要临床症状，引起猪的纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎，全世界均有发生[1]。随着养猪业的发展，规模化养殖和饲养的高度密，以及呼吸道综合征等因素，使得该病日趋流行，同时危害也日渐严重。HPS血清型很多，到目前为止为止,已确定的有15个血清型，其中血清型5、4、13最为常见，占70%以上。近年来，我国由副猪嗜血杆菌引起的猪多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，特别是在集约化猪场中，当蓝耳病，圆环病等发生后，在高密度饲养盒突发呼吸道疾病综合征的情况下，该病的临床表现和危害更为严重，造成更大的经济损失。

该病主要影响哺乳仔猪及4月龄以内的保育猪和生长育肥猪，其中以5~8周龄的保育猪更为多见，发病率一般在10%—25%，严重时可达60%，如果处理不及时，病死率可达50%。当反复遭受各种不良应激如寒冷、转群、换料、长途运输等的猪群往往危害更为严重。有个别卫生条件较好的猪场因不能执行全进全出，也有类似的疾病发生，而且受影响的猪只年龄范围也显著增宽，发病率和死亡率也较高。副住嗜血杆菌作为共栖菌而成为继发性病原菌，常在蓝耳病病毒、圆环病毒Ⅱ型、伪狂犬病毒及猪流感病毒等感染后继发感染,甚至与传染性胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、链球菌等混合感染,使病情复杂化,死亡率增加。由于本菌是一种条件性致病菌，因此饲养管理条件的改善可降低副猪嗜血杆菌的发病率，如注意环境卫生，处理好保温盒通风的关系，确保饲料的质量，减少应激等[2]。

2006年9月下旬，广东佛山某一猪场有部分约30日龄的仔猪发病，表现为精神沉郁、逐渐减食，被毛粗乱，体温稍有升高，呼吸急促，咳喘，腹式呼吸，大部分病猪耳朵、腹部皮肤及肢体末端等发绀,指压不褪色,拉稀，消瘦，关节肿胀，尤其是付关节和腕关节，跛行，共济失调。据场主叙述该群发病猪只的病程已有三四天，现有2头死亡。剖检可见猪胸腔内、心包膜内均有多量纤维性渗出物；肺脏病变尤其明显，除表面覆有大量纤维素性渗出物外，肺出血，肺纹理增粗；全身淋巴结肿大、暗红色；肾、十二指肠均有出血点，四肢皮下水肿，充满淡黄色胶冻状液体。场主按链球菌病、水肿病治疗无效。

据以上症状，怀疑为副猪嗜血杆菌病，随采集病料进行实验室病原分离鉴定及药敏试验。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1病料

来自广东佛山某养殖场送检的30日龄有上述症状的仔猪的肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结、鼻腔液、胸膜、心包积液、心血和关节液。

1.1.2培养基制作材料

营养肉汤粉、普通营养琼脂粉、麦康凯营养粉等。

1.1.3主要试剂

   金黄色葡萄球菌为佛山科学技术学院预防兽医实验室保存；生化微量鉴定管为浙江省军区后勤部卫生防疫检验所产品；药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司 ： V 因子 （NAD ， 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）购自上海伯奥生物公司 ； EX Taq DNA聚合酶（5IU/uL）、dNTPs、DNA Maker DL 2000等均由 TaKaRa公司提供，—20℃保存； 特异引物由上海博亚生物技术公司合成。

1.1.4实验器材

核酸扩增仪、电泳仪、光学显微镜、凝胶成像系统等。

1.1.5 实验动物

健康小白鼠等实验动物由佛山黄岐实验动物饲养场提供。

1.2           方法

1.2.1        培养基的制作

1.2.1.1普通平板的制作

营养琼脂33g，溶于1000ml蒸馏水中，分装，120℃30min高压。取出带温度下降至50℃~80℃于超净台倒平板，凝固后包装好放于37℃温培养箱中培养一夜，确认无菌后放冰箱保存，备用。

1.2.1.2血平板的制作

营养琼脂33g，溶于1000ml蒸馏水中，分装，120℃30min高压。取出带温度下降至50℃左右，倒入无菌的纤绵羊或家兔血液（按5%~8%配比）混匀，于超净台倒平板，凝固后包装好放于37℃温培养箱中培养一夜，确认无菌后放冰箱保存，备用。

1.2.1.3麦康凯平板的制作

麦康凯35g，溶于1000ml蒸馏水中，分装，120℃30min高压。取出带温度下降至50℃左右于超净台倒平板，凝固后包装好放于37℃温培养箱中培养一夜，确认无菌后放冰箱保存，备用。

1.2.1.4巧克力平板的制作

营养琼脂33g，溶于1000ml蒸馏水中，分装，120℃30min高压。取出带温度下降至75℃左右，倒入无菌的纤绵羊或家兔血液（按5%~8%配比）混匀，于超净台倒平板，凝固后包装好放于37℃温培养箱中培养一夜，确认无菌后放冰箱保存，备用。

1.2.1.4营养肉汤的制作

称取牛肉膏 5g、蛋白陈 10g、氯化钠 5g、磷酸氢二钠 1g、蒸馏水 1000mL，混合加热后用0.1mol/L氢氧化钠调至pH7.4~ pH7.6,分装烧瓶，每瓶约5mL，121℃高压灭菌15min~30min。取出待温度略下降后包装好放于37℃恒温培养箱中观察一夜，确认无菌后放冰箱保存，备用。

1.2.2        细菌的分离与纯化

     无菌采集鼻腔、肺脏、胸膜、心包积液、 心血和关节液等病料，分别接种于巧克力培养墓， 置于巧克力培养基，置于37℃恒温培养箱中培养约24h~48h。如果24h未见针尖或小露珠大小的菌落长出，可延长培养时间至48h。

     挑取可疑小菌落，进行革兰氏染色涂片镜检，步骤如下[3]：

（1）      涂片：在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，涂布分离菌株。

（2）      固定：将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰5~6次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

（3）      染色：初染，将载玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液（加量以盖满菌膜为度），染色1min，倾去染色液，用自来水小心地冲洗；助染，滴加碘液，染1min，同上水洗；脱色，滴加95%乙醇，脱色30s立即水洗；复染，滴加复红，染色1min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干后在光学显微镜下观察。

     挑选疑似HPS的细小菌落进行纯化培养，分别接种于麦康凯培养基、普通培养基、巧克力培养基、普通血平板各2份（各取1份置于5%~10%CO2中培养），37℃恒温箱培养24h~48h后，观察其在培养基上的生长表现、菌落特征，以及在血琼脂平板上的溶血性等培养特征。

1.2.3 V因子依赖性试验

   在无菌操作条件下，将HPS可疑纯培养菌株分别接种于两种营养肉汤中，一种是添加0.1mL V因子的营养肉汤，另一种是不添加V因子的营养肉汤，37℃恒温箱培养24h~48h后，对比观察肉汤的浑浊度，进而比较细菌的生长情况，检查其对V因子的依赖性。

1.2.4卫星现象试验

   在无菌操作条件下，用接种环挑取上述可疑菌的单菌落，用无菌棉签均匀涂布于普通琼脂平板上，再挑取金黄色葡萄球菌在上述平板中划一组平行线，37℃恒温箱培养24h~48h后，观察其是否在葡萄球菌周围长出“卫星现象”。

1.2.5生化鉴定

   在无菌操作条件下，在各生化鉴定管中加入2uL的1%的NAD溶液，然后取具有“卫星现象”且不溶血的单菌落纯培养后接种于生化微量鉴定管中，并及时用胶布封号，倒立置于一小烧杯后放入恒温培养箱中，37℃培养24h，取出观察结果，并参照常见细菌系统鉴定[4]。

1.2.6PCR鉴定

引物设计与合成参照Simone Oliveira等的报道[5],[6],[7]合成引物，引物序列为：

P1:5—TTA GCC TG CTC TTC TTA GCC—3（21 nt）

P2:5—AAG CTT GAAA ACTTAAG GGRA CTCTAA—（24 nt）

扩增片段大小为1900bp。

刮取单个待检菌落，溶于10uL灭菌蒸馏水中个，混合均匀作为反应模板。反应体系为： 10*PCR Buffer 25uL,dNTPs(2.5mM)2uL,P1(20pmol)和P2（20pmol）各0.5uL，ExTaq（5IU/uL）0.2uL,模板1uL，灭菌双蒸水18.3uL。混合均匀后置核酸扩增仪中执行以下程序：94℃ 5min，94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 3min，运行30个循环；最后于72℃延伸10min。反应结束后，取5uL PCR产物中1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像系统中观察结果。

 

图1 疑似副猪嗜血杆菌显微形态（10*100，革兰氏染色）

 

 

1.2.7 药敏试验

检测HPS菌株对16种抗生素的敏感性，将无菌棉签抽取分离菌的肉汤培养物，均匀涂布于巧克力平板上，待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴于培养基表面，每一平板分三个区域，贴3个药敏纸片，37℃培养20~24h后，观察并测定抑菌环直径的大小。

1.2.8 动物致病性试验

将10只健康小鼠随机分为两组，一组为对照组，另一组为实验组(每组5只，小鼠平均重量为21g)），对照组每只小鼠腹腔注射无菌的磷酸盐缓冲溶液（PBS）液体培养液0.2mL，实验组每只小鼠接种PBS稀释的HPS菌液0.2mL，饲养于实验室中，观察并记录其发病情况，持续多天，并对死亡小鼠取肝脏、腹腔积液等进行细菌分离鉴定。

 

2                 结果

2．1 直接涂片镜检

     对不同组织、部位所取的病料，经染色后均见到红色的细小杆菌，为革兰氏阴性杆菌。菌体形态多样，以纤细杆状着居多，间有长而弯曲丝状菌体，个别呈两极浓染的球杆状（见图1）。所查组织中，以心包膜和关节腔渗出物细菌最为密集。

 

 

2.2 分离培养及培养特性

在普通肉汤、普通营养琼脂和麦康凯培养基37℃培养24h~48h后，未见细菌生长。在血平板上培养48h，可见有针尖大小、圆形、边缘整齐、灰白色半透明的小菌落生长，不表现溶血现象；在巧克力培养基上培养24h后生长良好，形成针尖大小、圆形、半透明、光滑湿润的菌落（见图2）；挑取菌落染色镜检，符合副猪嗜血杆菌的形态和染色特征。其中以5%~10%培养的菌落较多，涂片镜检，形态和染色特征与直接涂片一致。

 

(图2 分离菌在培养基上的生长情况（左侧围鲜血培养基，右侧为巧克力培养基）

2.3 V因子依赖性试验结果

副猪嗜血杆菌对营养要求严格，人工培养时必须供给V因子才能生长。对比两种营养肉汤的浑浊度发现，添加了V因子的肉汤比不添加V因子的肉汤浑浊（见图3），说明其生长依赖V因子。

 

图3 分离菌在营养肉汤上的生长情况

（1：添加了V因子的肉汤；2：不添加V因子的肉汤；3：阴性对照）

2.4卫星现象试验结果

金黄色葡萄球菌可产生V因子，需V因子的副猪嗜血杆菌可在其周围呈“卫星现象”。结果在普通琼脂平板上金黄色葡萄球菌线两侧有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，离金黄色葡萄球菌越近菌落越大，越远菌落越小，远离葡萄球菌的地方甚至不生长，呈现出明显的“卫星现象”（见图4）；而在未接种金黄色葡萄球菌的普通琼脂平板上则不生长，不见“卫星现象”。

 

2.5 生化试验结果

   生化试验结果显示：尿酶阴性，氧化酶阴性，接触酶阳性，发酵葡萄糖、蔗糖、木胶糖、半乳糖和麦芽糖等（见表1）。

表1 分离菌的生化实验结果

2.6PCR鉴定结果

   经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察，发现被检菌株都有约1900bp的特异性条带（见图5）。

图5 分离菌株PCR结果电泳图

M：Marker DL 2000;1-2:HPS 可疑纯培养菌株；3：阴性对照

2.7药敏试验结果

   药物敏感性判定标准：抑菌环直接在15mm以上为高度敏感；10~15mm为中度敏感。药敏试验结果表明，该菌对氯霉素、氨苄青霉素、头孢氨苄、环丙沙星、头孢唑林、氨苄西林、头孢拉定高度敏感，对卡那霉素、红霉素、诺氟沙星、杆菌肽、庆大霉素、麦迪霉素中度敏感，对四环素、链霉素为低毒敏感，对磺胺甲基异恶唑为耐药（见表2）。

 注：抑菌圈直径在15mm以上者为高敏，10-15mm为中敏，10mm以下为低敏，无菌圈者为耐药。

2.8动物致病性试验结果

实验组小鼠在24h内，出现精神萎靡、食欲不振、呼吸急促、48h内全部死亡。无菌采集肺、肝等组织病料及腹腔积液接种到巧克力培养基和鲜血培养基，均长出圆形、光滑湿润、边缘整齐的中等大小的灰白色菌落。挑取单个小菌落涂片镜检发现菌株形态与上述鉴定的菌株形态极其相似。对照组小白鼠仍然很健康。

 

 

结论

从具体疑似副猪嗜血杆菌病特征临床症状的病死猪身上采集的病料，同细菌分离、涂片染色镜检、生化鉴定、卫星现象试验、V因子依赖性试验及PCR鉴定，最终确定所分离的细菌为副猪嗜血杆菌。

通过动物致病性试验及药敏试验可确定分离菌HPS具有致病性，并对氨苄青霉素类、氯霉素、头孢氨苄等药物高度敏感，该药敏试验对上述猪场发生副猪嗜血杆菌病的诊断及治疗可提供指导意义。

 

 

 参考文献：

 [1]季芳，宋长绪，杨增岐.猪副嗜血杆菌病的研究进展[J].广东畜牧兽医科技，2004,29（1）：19-22.

 [2]窦守强，罗满林，李和平.副猪嗜血杆菌感染的研究进展[J].广东畜牧兽医科技，2006 31（2）：22-24.

[3]姚火春.兽医微生物学实验指导（第2版）[M].北京：中国农业出版社，2002.

[4]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[5]Oliverira S,Galina L,Pijoan C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infectiongs [J].就VetDiagn Invest，2001,13（6）：495-501.

[6]张培君，孙惠玲，苗得园，等。猪胸膜肺炎放线杆菌和副嗜血杆菌的鉴别诊断及血清型鉴定[J].中国兽医杂志，2002,36（10）：18-20.

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[8]蔡旭旺，刘正飞，陈焕春，等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定[J].华中农业大学学报，2005,24(1):55-58.

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